用 Agilent 2100 芯片生物分析系統測定魚類的PCR-RFLP 圖譜
摘要
本應用報告介紹了安捷倫 2100 芯片生物分析系統在聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析鑒定魚類中的應用。先對所有脊椎魚類中存在的 464bp 細胞色素 b 目標序列進行擴增，然后用限制酶水解。在 DNA 500 LabChip® 上對這些片段進行分離，由于準確測定了片段大小，所以能與權威性的種類圖譜進行直接比較。與經典的凝膠電泳和 DNA 染色技術進行 PCR-RFLP 片段分析相比，使用芯片生物分析系統具有明顯的優勢。
前言
近年來提供給消費者的魚產品差別越來越大。從優質的魚肉到廉價的魚尾。魚產品要經過捕獲、加工到分銷至全球各地的過程，需要確定產品所用魚類的真實性和種 系。因此，需要一種可靠而簡便的種類鑒定方法，以支持標簽法的強制性規范（歐盟理事會規則第 104/2000 和 EC 委員會規則第 2065/2001）。
形態學鑒定法是適合整條魚的種系鑒定方法，但是，一旦進行了加工，魚種鑒定將變得很困難。蛋白圖譜也可以用來進行魚類鑒定，但這種方法需要和樣品一起分析 種類參考物質，由于加工過的食品中蛋白質已經變性，分析時可靠性較低。基于 DNA 的方法為魚類鑒定提供了另一種途徑，因為即使對于深度加工的樣品，其 DNA 還是可以檢測的。
直接測序是最權威的鑒定方法，但是對于懷疑或已知其含有一個以上種類的樣品，這種方法操作起來并不容易。因此，發展了其他的技術，用聚合酶鏈反應（PCR），以 DNA 指紋圖譜為基礎對魚類進行鑒定。
這些方法包括 RAPD（隨機擴增多態性 DNA）、SSCP（單鏈構象多態性）和 PCR-RFLP。
曾有報導 PCR-RFLP 技術用于鮭魚的鑒定 [1, 2]，包括用限制酶對擴增的細胞色素 b 464bp 進行裂解，產生 DNA 圖譜。
本研究的目的是用安捷倫 2100 芯片生物分析系統代替經典的凝膠電泳和染色步驟，對鮭魚和其它魚類的鑒定方法進行改進。在 2100 芯片生物分析系統上得到的種類特異性 PCR-RFLP 圖譜，以及對各 DNA 片段按大小精確排列和定量，與凝膠電泳方法相比，具有簡便、快速、鑒定精確等明顯優勢。
實驗方法（詳見原文）
- 材料與方法
- 魚類樣品
- DNA提取
- DNA擴增
- PCR-RFLP 圖譜
結果（詳見原文）
- 用 2100 芯片生物分析儀上得到的 PCR-RFLP 圖譜進行魚類鑒定
- 實驗重復性
- 魚類的鑒定
討論
要鑒定事先不了解的樣品中的魚類時，需要有一種通用的方法。所有魚類都有脊椎動物細胞色素 b 基因，用這一常見區域的 PCR-RFLP 圖譜與數據庫中的圖譜進行比較，是一種通用的方法。
常規的 PCR-RFLP 片段分析包括在大（30 cm2 ）而薄（<2 mm）的聚丙烯酰胺凝膠上進行凝膠電泳，以分離 PCR-RFLP 圖譜。這種方法操作和染色非常困難，而且要使用大型設備和大量溶液。所有這些使這種方法具有一定的危險性，而且很費時間，有時結果的變異性也較大。因此， 這種檢測方法不適用于要求檢測方法快速、耐用的執行與質量控制實驗室。
作為另一種選擇，2100 芯片生物分析儀將常規毛細管電泳技術與操作簡便的芯片形式相結合，可以對各DNA 片段大小進行精確測定和定量。再結合一塊小小的 LabChip，（2 cm2 ），使這種系統與經典的凝膠分析法相比，在操作的簡便性、速度和安全性方面具有明顯的優勢。從而使 2100 芯片生物分析系統特別適合多個 DNA 小片段的分析，例如 PCR-RFLP 圖譜的分析。
用 2100 芯片生物分析系統得到了以前報導過的鮭魚類 PCR-RFLP 圖譜。但 2100 芯片生物分析儀上得到的圖譜在片段分辨率和檢測方面都有了改進，特別是那些用經典凝膠電泳檢測不到的較小片段。與凝膠電泳相比，在 2100 芯片生物分析儀上得到的圖譜均一性更好。
用 DdeI、HaeIII 和 NIaIII 三種酶得到的圖譜對 19 種商業上重要的魚類鑒定。下一步將繼續增加數據庫中魚類的種類，使其成為研究魚產品真偽的重要工具。
本方法研究的所有細節，對魚產品鑒定的應用，以及實驗室間研究已于近期發表 [3, 4, 5]。
