用 1.8 μm 反相 (RP) 色譜柱進行快速氨基酸分析 (AAA)
摘要
氨基酸分析 (AAA) 常被用作蛋白質組學和食品質量檢測中測定樣品中氨基酸 (AA) 準確組成的工具。為了及時分析樣品，需要分析周期短；為了測定有限量的樣品需要高靈敏度的方法；為了提高實驗室效率，需要自動化的方法。本文報道了用新開發的 1.8 µm 粒徑色譜柱測定氨基酸的新方法。這種專利的填料經過專門設計，其產生的反壓比市場上任何其它亞 2 微米填料都小，可以在 400 bar HPLC 系統以及耐壓更高的儀器上使用。我們采用惠普/安捷倫公司 1988 年首次推出的 OPA/ FMOC 化學衍生法，并改善了以前方法的精密度、分析時間、柱壽命和耐用性 [1-4]。
引言
氨基酸的檢測和定量分析一直是蛋白質和食品分析的重要部分，1951 年 Moore 和 Stein 研制出了第一臺氨基酸分析儀，將未衍生的氨基酸 (AAs) 用離子交換色譜分離后，用茚三酮進行柱后衍生，在可見區檢測[5]。1958 年由 Beckman 開發并推出了全自動分析儀。它成為蛋白質分析的里程碑，并在 1972 年諾貝爾化學獎核糖核酸酶的研究中發揮了重要作用。以前需要幾周完成的分析，用該方法不到 1 天就可以完成。Beckman 新一代的氨基酸分析儀已將分析時間縮短到大約 110 分鐘，但用茚三酮靈敏度仍然有問題。
用鄰苯二甲醛 (OPA) 和巰基乙醇進行柱后衍生反應有一些可能，但卻只能檢測一級氨基酸（見圖 1a）。1971 年首次報道了用 OPA 對氨基酸進行柱前衍生[6]。衍生物相當不穩定，但這一過程可以實現自動化。靈敏度得到了提高，特別是使用熒光檢測 (FLD)時。OPA 不發熒光，其衍生物有很強的熒光，但二級氨基酸仍不能檢測。另一種衍生化試劑氯甲酸 9-芴基甲酯 (FMOC) 和一級、二級氨基酸都能反應生成穩定的衍生物，但其本身卻具有很強的 UV 吸收和熒光（見圖 1b）[7]。衍生反應結束后還需要進行提取或與疏水性很強的胺進行反應，以除去過量的 FMOC 和反應副產物 [8]。這種方法也可以作為自動化柱前衍生方法 [9]，但商品化時存在問題，與沒有使用反提取的系統相比，相對標準偏差 (RSD) 較高。
1986 年惠普/安捷倫將這兩種化學反應依次結合，不用反提取實現了蛋白質水解液氨基酸的全自動衍生、色譜分離、檢測和報告 [1]。1988 年開發并銷售了商品化的分析儀，總分析時間只有 36 分鐘，靈敏度達到飛摩爾水平。這對于生物技術公司和大學的研究人員來說，無疑是邁向正確方向的一步，因為他們的樣品非常有限，尤其是在藥物研發的早期階段。
為了使其在商業上可行，需要進行一些化學上的改進：將硫醇換成 3-巰基丙酸 (MPA) 使 OPA 衍生物更穩定；所有一級氨基酸先與 OPA 反應，將一級氨基酸從下一步的反應中定量除去；然后加入 FMOC，FMOC 只與二級氨基酸反應。由于 FMOC、FMOC 衍生物和反應副產物比任何 OPA 衍生物的疏水性都強，所以它們不會干擾任何一級氨基酸的檢測。因為只有幾種FMOC 衍生物，所以可以使用簡單的兩段梯度將這些氨基酸與反應副產物和FMOC 分離 [1]。詳見圖 1 和圖 2。相應于各個色譜峰的化合物名稱見表 1。
實驗部分
儀器
本文中的結果都是在 Agilent 1200SL HPLC 系統上測定得到的，該系統包含以下組件：
G1312B，SL 型二元泵
G1379B，微量脫氣機
G1367C，高性能多孔板自動進樣器 (WPS)，配置
54 x 2 mL（前面）和 15 x 6 mL 樣品盤（后面）
G1316B，SL 型柱溫箱 (TCC)，安裝低擴散組件
G1315C，SL 型二極管陣列檢測器 (DAD)，配置半微量流通池
G1321A，熒光檢測器 (FLD)
儀器上的所有管線內徑均為 0.12 mm（0.005 英寸）。
其它詳見原文
結果與討論（詳見原文）
分離條件的選擇
重復性和線性
擴展氨基酸 (EAA) 和內標 (IS)
實際樣品
圖 8 顯示了各種窖裝啤酒的比較結果。
結論
本工作對氨基酸分析方法進行了各方面的改進。使用1.8-µm 粒徑色譜柱可使分析周期縮短一半，從 35 分鐘左右縮短到 13.5 分鐘左右。最早洗脫的天門冬氨酸和谷氨酸的峰形都得到了改善。提高了二級氨基酸，以及反應最慢的氨基酸，如賴氨酸的重復性。線性良好（r 2 接近 1），平均峰面積重復性低于 2%。報道了各種內徑（從 2.1 到 4.6 mm）的新快速分離高通量Eclipse Plus C18，1.8-µm 柱的使用。新的流動相和進樣器條件非常簡單，只要簡單地改變流速就可以在2.1-到 3.0-或 4.6-mm 內徑柱之間進行轉換。也可以使用快速分離高通量 Eclipse Plus C8 或快速分離高通量 Eclipse XDB-C18 或-C8 柱（數據未顯示）。
