用GC/MS/MS和反吹技術快速篩選和確認奶粉及大豆中三聚氰胺及其類似物

摘要

      通過利用安捷倫 7890A/7000A 系列帶 Ultimate Union 吹掃的三重串聯四極桿 GC/MS 聯用和反吹技術，開發了一種快速篩選和確認嬰兒奶粉和豆制品中的三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的方法。該方法中的提取及衍生過程與 FDA（美國食品和藥物管理局）的 GC/MS 方法相同。在 0.16到 2.5 ppm 的濃度范圍內可獲得卓越的線性度（R2>0.99），且運行時間不到 15 分鐘。

前言

      由于在美國生產的奶粉、分布于加拿大市場的巧克力、在荷蘭銷售的餅干、在泰國銷售的煉乳以及在香港銷售的雞蛋中均檢測到了三聚氰胺，在食品中攙雜三聚氰胺 已迅速成為一個國際問題。對此，許多國家已經建立了針對三聚氰胺的許可濃度限制，如 FDA要求嬰兒奶粉中三聚氰胺的最高殘留限量 (MRL) 為百萬分之一 (1  ppm)，其他產品則為 2.5  ppm。FDA的 GC-MS 篩選法 [1] 能夠檢測的三聚氰胺及其類似物 (三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸) 的靈敏度為 2.5 ppm。然而，FDA 在 2009 年 2 月的進口警報要求所采用的測試方法對于三聚氰胺及其類似物的檢測靈敏度必須達到 0.25  ppm，以保證檢測結果符合 MRL 規定。因此，在新的規定下，FDA 的 GC-MS  篩選法已不能適用于篩選三聚氰胺及其類似物，其確認也需要通過額外的正交法進行。

      本應用中說明的方法對 FDA 的 GC–MS 篩選法進行了改進，采用了新型 Agilent 7000A 系列三重串聯四極桿 GC/ MS 聯用技術。改進后的新方法不改變樣品的提取和衍生程序，通過使用帶吹掃接頭的氣相色譜柱和反吹技術，使得運行時間在 15 分鐘以內。該方法可以使三聚氰胺及其類似物的檢測精度達到 0.25 ppm，其定量也具有高度的重現性和準確性。最重要的是，這種方法經一次短時間運行就能實現三聚氰胺及其類似物的篩選、定量和確認。


實驗

儀器

      實驗所采用的儀器包括配置分流/不分流毛細管進樣口的安捷倫 7890A 氣相色譜儀、配置三重離軸檢測器的安捷倫 7000A 系列三重串聯四極桿 GC/MS 聯用儀以及安捷倫 7683B 全自動液體進樣器 (ALS)。分流/不分流進樣口裝有一個長壽命隔墊 (部件號 5183-4761)和一個去活的分流單錐形注射襯管  (部件號  5181-3316)。用 10 µL 注射器 (部件號 9301-0714) 注射。各儀器使用條件列于表 2。（詳見原文）


結果與討論

帶 Ultimate Union 吹掃系統的反吹技術

      反吹技術可以從色譜柱中除去高沸點物質，通過將后流出的組分從進樣口的分流放空口中反吹出去，而使高沸點組分不經過整個色譜柱，也不進入 MSD。反吹可以降低化學噪音和分析周期時間，從而提高檢測效率。由于減少色譜柱和質譜檢測器的維護時間，系統的正常運行時間也有所增加。安捷倫微板流路 控制技術模塊包括一個專有的解決方案，能夠快速簡便地實現反吹，死體積小，從而提高分離度。該模塊還包含墊圈和接頭以消除漏氣。所有微板流路控制技術模塊 都需要使用輔助電子氣動控制 (EPC) 模塊或氣動控制模塊 (PCM) 來提供精確控制的第二氣源，以引導色譜柱氣流能流向正確的色譜柱或檢測器。在正常操作時，PCM  的壓力等于或略高于通過色譜柱的載氣壓力。在反吹過程中，進口壓力下降到 1 psi，而 PCM壓力增加，從而驅使色譜柱氣流反向流經色譜柱，并吹掃出進樣口。

      一個替代反吹的獨特方法是在分析柱的中部使用微板流路控制技術裝置。此時，采用兩個 15 米色譜柱替代  30  米色譜柱，兩個色譜柱由超低死體積吹掃Ultimate Union 連接（如圖 1 所示），PCM 則只提供足夠的補充氣與從第一個色譜柱中的氣體流量相匹配。由于只有最優的載氣流量進入質譜儀，因此需要增加的氣流很小，不會發生靈敏度降低。該配置的反 吹過程，是通過降低第一個色譜柱的流量和壓力，增加第二個色譜柱的流量和壓力來完成的。

      圖 2 給出了具有吹掃終端配置的反吹的例子。圖中上端的圖譜顯示了六個標樣，其中第三個峰被認為是最后一個感興趣的峰，第四個峰是第一個高沸點組分干擾物。中圖 顯示了 (a) 相同標樣在 10.1 分鐘開始反吹，其中流量在第一個 15 米色譜柱中下降，(b) 在第二個色譜柱上升。a 和 b 點之間的時間是最后要分析的組分在第二個色譜柱中的停留時間。最后的組分被保留，但后洗脫物不會進入到質譜檢測器中。下圖說明在接下來的空白運行中沒有交 叉污染。或者，可以在最后一個感興趣的峰被流出（b  點）后開始反吹。這就避免了需要通過實驗來確定最后流出的目標化合物在第二色譜柱中的停留時間，從而縮短運行時間周期。


三聚氰胺及其類似物的分析

      基于三重串聯四極桿 GC/MS  聯用系統，我們開發了一種一次運行就能出色的分離和分析三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的新方法，且運行時間不到 15  分鐘 (圖 3)。新的三重串聯四極桿GC/MS 法顯著提高了檢測靈敏度和選擇性，圖 4  給出了其與 GC/MS 選擇離子檢測 (SIM) 的對比。新方法能夠在 0.25 ppm 靈敏度下對三聚氰胺進行非常干凈地定量 MRM 分析，而不管采用何種 SIM 離子，GC/MS SIM 法都難以在 2.5 ppm 靈敏度下有效地減少化學噪音。

靈敏度與定量

      在基質（包括嬰兒奶粉和豆粉）中分別加入三聚氰胺及其三種類似物的標準品，濃度分別為 0.78 、1.25、3.9 和 12.5 ng/mL，對應于 0.16 到 2.5 ppm 的檢測確認水平。并針對每種基質中的四種化合物建立校準曲線。圖 5 和圖 6 表明，三聚氰胺及其三個類似物的曲線均顯示出了極好的線性，R2 的值非常接近 1.00。表 4 和表 5 表明，對兩種基質中四種化合物的定量準確性也非常高。（圖詳見原文）

確認

      為了確定一套可廣泛接受的程序來對限定物質進行科學確認，歐盟科學家開發了“識別點”系統。分析方法提供的識別點越多，越能肯定所確認的化合物的存在。確 定化合物的 MRL  要求有三個識別點。當由于化合物的毒性而無法界定其 MRL  時，則該化合物在所有級別上都是被禁止的。這些化合物要求有四個識別點。當 GC/MS  需要監測四個離子以提供四個識別點時，使用三重串聯四極桿的 GC/MS/MS  聯用儀則只需監測兩個選擇反應監測 (SRM) 通道。利用三重串聯四極桿 GC/MS  系統分析三聚氰胺及其類似物需要利用至少兩個 SRM  通道，可以在單次運行中獲得有效篩選和完全確認。

      圖 7 和圖 8 顯示了嬰兒奶粉和豆粉中的四種化合物GC  分離的定量和定性離子通道的色譜圖。每一種情況定性離子都對定量離子進行了歸一化處理，以便從兩個離子的輪廓圖中能更好的顯示出一致的峰形。因此，這些離 子輪廓圖為每個樣品基質中的四種化合物都給出了完全的確認。（圖詳見原文）


結論

      為了在一次短時間運行中就實現對三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的篩選、定量和確認，通過應用安捷倫科技公司的三重串聯四極桿GC/ MS 聯用系統，對 FDA 的 GC/MS 篩選方法進行了改進。該方法不改變原有的提取或衍生程序，且其運行周期時間僅約為 15 分鐘。此外，該方法符合新的FDA  測試要求，即測試靈敏度應達到 0.25  ppm，并且在 2.5  ppm  的濃度范圍內表現出了優異的定量線性，定量精度達到 97% 以上。為了對陽性確認提供有效的識別點，分別給出了四種化合物的兩個 SRM 通道。