多元數學統計方法分析傳統草藥

多元數學統計方法分析傳統草藥，使用  U P LC 超高效液相色譜/T O F -MS 飛行時間質譜比較不同樣品種類

Kate Yu, Jose Castro-Perez, 和 John Shockcor
沃特世公司，米爾福德，馬薩諸塞州，美國

前言
實驗方法
傳統草藥 (THM）或傳統中藥 (TCM）樣品的分析研究是非常具有挑戰性的，直接原因是樣品的重現性差。植物提取物的成分會因產地，采收季節以及提取方法的不同而發生顯著變化。即使提取物是來自同一株植物的提取物或來自相同名稱的兩株植物，其成分也不盡相同。  

此外，為了有效的對中藥進行質量控制，非常有必要對中草藥進行分析比較。中草藥樣品分析對于傳統草藥的生理作用機理的研究也是非常關鍵的。  

我們開發了一套簡便快速且易于通用的傳統中草藥分析流程的(圖 1)。該分析流程利用了沃特世 (Waters®) UPLC® 超高效液相色譜的技術優勢，即高分辨，高靈敏度和快速分離，并結合了  SYNAPT™  HDMS™  質譜系統的飛行時間質譜儀(TOF  MS) 精確質量數測定的功能。該工作流程能夠應用于化合物鑒定或樣品解析。  

傳統中草藥中的化合物鑒定在我們已在另一篇應用紀要中討論過。1  本文將演示如何利用該分析流程借助多元數學統計方法進行樣品數據的解析。結果表明，樣品的比較可以在幾個小時內完成并獲得完整的樣品信息。這顯著地縮短了傳統草藥樣品的分析時間和節省了人力。

圖 1. 傳 統 草 藥分析 的工作 流程 。

本實驗的樣品來自于兩種人參提取物口服液。
樣品 1 是人參精口服液 (產自中國，JV Trading Ltd. 公司銷售，紐約，紐約州)。
樣品 2 是青春寶口服液 (產自中國，Overseas Factor Corporation 公司銷售，舊金山，加利福尼亞州)。  

每個樣品在進樣前先過濾。

液相條件

液相系統:     沃特世 ACQUITY UPLC® 超高效液相色譜系統
色譜柱:        ACQUITY UPLC 超高效液相色譜 HSS T3 色譜柱
                    2.1 x 100 mm, 1.7 µm, 65 °C

流速:              600 µL/min  
流動相 A:       水+ 0.1% 甲酸
流動相 B:      甲醇

梯度:        時間        組成         曲線
               0 min      95% A   
               10 min    30% A    Curve 6
               17 min    0% A      Curve 6
               20 min    95% A    Curve 1

質譜條件
質譜系統:     沃特世 SYNAPT HDMS 質譜系統
離子化模式:     電噴霧
毛細管電壓:      3000 V
錐孔電壓:       35 V
除溶劑溫度:      450 °C
除溶劑氣體:     800 L/Hr
離子源溫度:     120 °C
采集范圍:     50 to 1500 m/z
碰撞氣體:     氬氣

數據處理
化合物篩選和分析:  
    MarkerLynxTM
    應用管理軟件
多元數學統計分析:   
    SIMPCA-P

結果
為保證數學統計結果的可靠性和重要性，每個樣品至少重復進樣三次。為獲得每個樣品的所有信息，有必要對它們在正負離子模式下進行LC/MS分析。本實驗中，每種樣品重復進樣六次:三次電噴霧正離子模式分析和三次電噴霧負離子模式分析。出于演示目的，本文只討論了負離子模式下的結果。   

圖 2 顯示兩種人參提取物口服液基峰離子色譜圖的比較。由圖可以看出人參精口服液含成份遠多于青春寶并且濃度更高。由于兩個樣品成份都很復雜，有必要利用多元數學統計工具對兩個樣品做進一步的分析。

圖 2. 兩種人參提取物樣品的 LC/MS 液相色譜/質譜基峰離子色譜圖。

使用多元數學統計方法對 LC/MS 數據進行分析的第一步是將三維 LC/MS 數據轉換成二維矩陣。這一關鍵步驟由 MassLynx™ 操作軟件中的 MarkerLynx 完成。MarkerLynx 將每一個數據點轉換成精確質量保留時間 (EMRT) 數據對，并以二維矩陣型式將結果列出 (圖 3)。  
 
本實驗共得到了 1184 個精確質量保留時間 (EMRT) 數據對 。可檢測到 EMRT 數據對的數量取決于色譜峰檢測限的設定，該參數可由分析人員設定。
 

圖 3. MarkerLynx 結果顯示窗口。窗口上部為樣品進樣列表。窗口下部為精確質量于保留時間數據對列表。  

從 MarkerLynx 報告界面上，僅需點擊  P+ 按鈕，EMRT 數據對列表就可以被自動導入到  SIMCA-P  中。首先利用主成分分析 (PCA) 法對對數據進行處理。之后利用無監督統計學模型，結合正交偏最小二乘法進行兩維數據分析  (OPLS-DA)。圖  4  列出正交偏最小二乘法數據分析的分值結果。該圖清晰地展示了兩個樣品組在 X 軸和 Y 軸方向的差別。


圖 4. 數值圖表示人參精口服液和青春寶口服液明顯的分組情況。

為進一步鑒定兩組樣品的化學組成上的差異性，正交偏最小二乘法得到的數據分析結果散點圖如圖 5 所示。


圖 5. 基于正交偏最小二乘法獲得的人參精口服液和青春寶口服液數據分析結果散點圖。

在散點圖中，每個點代表一個精確質量保留時間數據對。X軸表示可變量。一個數據點距離  0  越遠，該點對樣品差異的貢獻越大。Y  軸表示在同一樣品組中的樣品間的相關性。精確質量與保留時間數據對距離 0 值越遠，進樣間的相關性越好。因此，在 S 型曲線兩端的 EMRT 數據對代表了來自每個樣品組的可信度最高的特征離子。


例如，圖  5  中，接近  S  圖右上角的  EMRT  數據對為來自青春寶口服液可信度最強的特征標記物，接近 S 圖左下角的 EMRT 據對為來自人參精口服液可信度最強的特征標記物。

這些特征的  EMRT  數據對可以被選擇性地捕獲，并獲得每組樣品中特征標記物列表，并以  TXT  文件保存下來。這個  TXT 件可被輸回 MarkerLynx ，產生一個結果列表，從而用于元素組成搜索以及數據庫搜索。圖 6 顯示了從兩組樣品 S 圖中獲得的十個特征的精確質量與保留時間數據對列表。


圖 6. 利用正交偏最小二乘法從兩個樣品數據分析散點圖中獲得的最高貢獻的十個精確質量保留時間數據對列表。

圖 6 表明保留時間為 6.45 分鐘質荷比為 945.5419 離子是人參精樣品中最顯著的標記物，可信度達 0.999。保留時間為6.33  分鐘質荷比為  801.5021  的離子是青春寶樣品中最顯著的標記物，可信度達 0.994。  

此外，相比人參精樣品(從質荷比 783 到質荷比1187)，青春寶樣品中最特征的十個  EMRT  數據對在較低的分子量范圍內  從質荷比  623  到質荷比  955)。這說明人參精樣品的十個特征的標記物中的大多數含有三至四個糖環，而青春寶樣品中最特征的十個標記物含有二至三個糖環。

差異性最大的十個 EMRT 數據對也可以用棒狀圖格式進行查看。圖 7 列出人參精 (7a) 和青春寶 (7b) 十個差異性最大的標記物的棒狀圖。


圖 7. 人參精 (7a)和青春寶(7b)十個差異性最大的標記物的棒狀圖。

棒狀圖提供了列表中已經鑒定的標記物的額外信息，顯示被研究的兩個樣品組十個差異性最大的 EMRT 數據對的直接比較結果。在圖 7 中，人參精樣品的十個特征標記物在青春寶樣品中幾乎沒有被檢測到。而來自青春寶樣品的十個特征標記物在人參精樣品中被檢測到具有很低的強度，有些也未能檢測到。  

此外，棒狀圖也提供了一些半定量的信息。來自青春寶樣品的十個最大標記物比在人參精樣品中檢測到的強度高。表明青春寶口服液是比人參精口服液更純的提取物。

如上所述，從 SIMCA-P 得到的文本文檔可以直接導入 MarkerLynx 結果列表中。圖  8  顯示填入兩組結果的  MarkerLynx  結果窗口界面，每個表格代表一組。


圖 8. 導入精確質量與保留時間數據對的 MarkerLynx 結果顯示窗口界面， 文本文檔從 SIMCA-P 散點圖獲得。

從  MarkerLynx  結果表格中，可以對每一個  EMRT  數據對報告中的精確質量進行元素組成分析檢索。此信息可進一步用于作現有數據庫搜查，尋找推斷的該成分的化學結構(如果
數據庫中存在該種標記物)。  

舉例來說，我們從青春寶樣品中選擇一個質荷比為 971.4880 的 標 記物，其元 素 組 成 為  C48H76O20，對公共 平臺數據庫，Chemspider 進行檢索。其中一個可能性如圖 9 所示。


圖 9. Chemspider 數據庫中檢索的到的質荷比 971.4880 的可能結構。

從該信息很容易返回到液相色譜/質譜 LC/MS 原始數據，利用飛行時間 TOF MSE 數據1的碎片離子來確認推導的結構的準確性。

結論
本應用文集演示一種通用智能化的傳統中草藥樣品分析的工作流程。相對于傳統的分析方法，當前這種方法對于相當復雜樣品的分析非常有效。

通過 UPLC® 超高效液相色譜/SYNAPT™ HDMS™ 質譜系統的進行飛行時間質譜分析，首先采集含有精確質量測定的原始數據。當將這些數據作為精確質量保留時間數據對轉成二維矩陣形式，多元數學統計分析方法即可對這套數據進行分析。每個樣品的最特征的離子可以從  SIMCA-P  的正交偏最小二乘法數據分析散點圖中獲得。結果可以導回 Markerlynx 的結果列表中。如果標記物是已經解析出的化合物，可利用數據庫檢索其元素組成及化學結構。  整套分析方法簡便，快速適用性強。它可以很方便地應用到不同類型的傳統中草藥樣品分析之中。因此，在顯著節省資源的同時獲得最大信息量。

參考文獻
1.  An Intelligent Workflow for Traditional Herbal Medicine: Compound
Identification by UPLC/TOF MS. Yu K, Castro-Perez J, Shockcor J. Waters
Application Note. 2008; 720002486EN.

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