使用AB SCIEX TripleTOF™ 5600系統的深入挖掘工作流程

摘要

運用質譜對復雜樣品分析中的蛋白質組學研究和生物標志物發現是一個重大的挑戰。

由于樣品復雜性增加，所以需要更高靈敏度和寬動態范圍的強大儀器硬件支持。對復雜樣品的徹底分析也是同樣重要的，需單次LC/MS/MS運行中，在沒有質量損失前提下獲得最多數量的MS/MS譜圖。

AB SCIEX TripleTOF™5600系統具有快速掃描速度和高靈敏度，對于復雜混合物，可提供全面的定性挖掘（Explore）、快速分析（Profiling），高分辨定量（quantitation），僅在TripleTOF™5600一個平臺上、單次運行即可完成上述流程。運用強大的IDA（信息依賴采集）工作流程，該系統每秒可以采集50張MS/MS譜圖。即使在最快的采集速率下，TripleTOF™5600系統也可獲得高分辨率、高質量精度的MS和MS/MS，這在其它系統上是不可想像的。在TripleTOF 5600系統上可進行許多定性和定量工作流。這里，我們聚焦于整套系統方案獨特的性能，深入挖掘復雜混合物，獲得可信的結果。

 

分析復雜蛋白質組的整套系統解決方案

TripleTOF 5600系統可在保持高分辨率和高質量準確度下，高速地采集MS和MS/MS數據。
      帶有cHiPLC nanoflex的Eskigent nanoLC Ultra系統，可進行高質量的分離，并具有最高的重現性。
     對數據進行更深入的挖掘，要求數據庫搜索算法能夠在寬范圍下檢測許多不同的翻譯后修飾。ProteinPilot軟件帶有專利的Paragon算法，可對成百上千的修飾、取代和沒有預測的斷裂進行同時的鑒定。

儀器

TripleTOF 5600系統

Eksigent nanoLC 超快速液相色譜

圖1 用Explore工作流來進行全面的蛋白質鑒定。在Explore工作流程中，采集高分辨的TOF質譜圖，并選擇母離子用于后續的MS/MS。在該流程下，設置采集方法，使更多的時間花在MS/MS模式上，獲得最豐富的多肽鑒定，更高的蛋白質組覆蓋率。要求至少花20 毫秒來獲得高質量的MS/MS譜，獲得非常高的采集速度。

方法：

樣品制備：酵母胞溶物Yeast cell lysate，用RapiGest變性，然后還原、烷基化。過夜酶解。最終濃度為400 ng/mL。

色譜：Eksigent nanoLC-Ultra 2D系統，結合cHiPLC-Nanoflex系統，用Trap-Elute模式。

質譜：TripleTOF 5600系統，具有高靈敏度、極快的MS/MS采集速度，用IDA進行MS/MS只需20毫秒的累積時間，優化IDA工作流后，IDA方法為：一個高分辨的TOF survey掃描，然后進行每秒50張MS/MS的掃描，最短的累積時間為20毫秒。

圖2 IDA Information Dependent Workflow信息依賴采集工作流。在高速下采集MS/MS要求軟件優化。用戶可設置最大數量的母離子和最小的累計時間。采集過程會自動生成母離子列表，在每個cycle中，累積時間將根據被檢測到的母離子動態地分布。

數據處理：所有的數據使用ProteinPilot軟件4.0版進行處理，該軟件帶有集成的假發現率分析（false discovery rate, FDR）。使用ProteinPilot Descriptive統計模板進一步的數據分析。

圖3 酵母溶胞液的蛋白和多肽鑒定。單次進樣分析，使用變化的梯度時間和變化的上樣量。提高上樣量，將鑒定出更多的蛋白和多肽

更詳細信息，請看原文.....

用TripleTOF 5600系統進行蛋白鑒定的主要特點：

1、在MS和MS/MS模式下同時具有高質量準確度、高靈敏度和高分辨率；

2、高采集速率最高達：IDA模式下每秒50張MS/MS，并且不損失分辨率和質量準確度

3、數據庫搜索時使用更嚴格的質量偏差容忍率、可獲得更高確定性、更高信心的結果

4、優良的動態范圍，有更高的覆蓋率

結論

如上所示，在液相系統的高壓及低梯度下，系統可快速采集數據，最大采集能力是每秒50張MS/MS譜圖。大量的高質量的譜圖數據為肽和蛋白的鑒定增加了可信度。

使用TripleTOF 5600系統和軟件4.0 ProteinPilot可使您獲得2個ppm以下的質量精度數據。此外還可同精確的液相色譜分離系統——Eksigent nanoLC Ultra 帶有cHiPLC-nanoflex的超快速液相色譜聯用。TripleTOF 5600系統為蛋白質組研究提供了強大的解決方案。